GİRİŞ

Enterobacterales üyelerinden Klebsiella pneumoniae, geniş infeksiyon spektrumu ve artan antibiyotik direnci nedeniyle önemli bir fırsatçı patojen olarak tanımlanmaktadır (1). Yatay gen transferi yoluyla direnç genlerini kolaylıkla kazanabilen bu bakteri, çoklu ilaç direnci geliştiğinde tedavide sıklıkla son çare antibiyotik olan kolistin kullanılmaktadır (2). Ancak son yıllarda kolistin dirençli suşların varlığı bildirilmiş ve bu direncin kromozomal mutasyonlar, plazmid aracılı genler ve lipopolisakkarit (LPS) modifikasyonlarıyla ilişkili olduğu gösterilmiştir (3). Plazmid aracılı dirençten sorumlu olan mcr genlerinin gıda ürünleri, çevresel örnekler ve klinik izolatlarda saptanması, direncin hızla yayılabileceğini ortaya koymaktadır (4). Bu genler, Gram-negatif bakterilerin dış membranındaki lipid A’ya fosfoetanolamin eklenmesini sağlayan transferaz enzimlerini kodlayarak kolistin direncine yol açmaktadır (5). mcr genleri arasında en yaygın olan mcr-1, yaygın olarak Escherichia coli, K. pneumoniae, Salmonella enterica, Enterobacter cloacae ve Klebsiella aerogenes’te görülmekle birlikte, deneysel olarak Pseudomonas aeruginosa’ya da aktarılabilmektedir. Bu genler, genişlemiş spektrumlu beta-laktamaz (GSBL), New Delhi metallo-beta-laktamaz (NDM) ve metallo-beta-laktamaz (MBL) gibi direnç genleriyle birlikte taşınarak pan-ilaç direncine zemin hazırlayabilmektedir (5). 2016 yılı başlarında yapılan çalışmalarda mcr-1’in 18’den fazla ülkede bulunduğu bildirilmiş, bu durum yayılım hızının ciddiyetini ortaya koymuştur. Çiftlik hayvanları, kümes hayvanları ve insanlar önemli rezervuarlar olarak tanımlanmıştır (6). Ayrıca, Asya ve Avrupa’nın farklı ülkelerinde yapılan çalışmalarda mcr-1’in geniş coğrafi dağılımı ortaya konulmuş ve hayvanlardan insanlara geçişin birçok ülkede gözlendiği bildirilmiştir (7). 2019 yılı itibarıyla mcr-1 ile mcr-9 arasında dokuz farklı mobilize kolistin direnç geni tanımlanmış, 2020’de bu listeye mcr-10 geni eklenmiştir (8). Kolistin direncinin plazmid aracılığıyla aktarılabilmesi, karbapenem dirençli Enterobacterales infeksiyonlarının tedavisini güçleştirmekte ve kolistin direncinin yanı sıra plazmid aracılı direnç genlerinin izlenmesini zorunlu hale getirmektedir (4).

Bu çalışmada, Ekim 2017 – Ağustos 2020 tarihleri arasında laboratuvarımıza gönderilen hasta örneklerinden izole edilen kolistin dirençli K. pneumoniae izolatlarında plazmid aracılı direnç genlerinin varlığının araştırılması amaçlandı.

YÖNTEMLER

Şekil 1. Kolistin Sıvı Mikrodilüsyon Testi
ÜK: Üreme kontrol, BK: Besiyeri kontrol

Ekim 2017–Ağustos 2020 tarihleri arasında Mikrobiyoloji Laboratuvarı’na gönderilen farklı klinik örneklerden elde edilen ve konvansiyonel yöntemler ile gerektiğinde MicroScan (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) ve Vitek® 2 (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Fransa) otomatize sistemleri kullanılarak K. pneumoniae olarak tanımlanan izolatlar arasından kolistin dirençli olanlar seçilerek “skim milk” besiyeri içinde -80°C’de saklandı. Otomatize sistemle kolistin dirençli bulunan izolatlar, referans yöntem olan sıvı mikrodilüsyon (SMD) yöntemi ile test edildi. Kontrol olarak kolistin duyarlı E. coli ATCC® 25922 ve kolistin dirençli E. coli NCTC 13846 suşları kullanıldı. 18–24 saat 37°C’de inkübasyon sonrasında, üremenin olmadığı en düşük kuyucuktaki konsantrasyon değeri minimum inhibitör konsantrasyon (MİK) değeri olarak belirlendi. Kolistin duyarlılık sonuçları, çalışmanın yürütüldüğü dönemde geçerli olan Avrupa Antimikrobiyal Duyarlılık Testleri Komitesi (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing, EUCAST) 2022 kriterlerine göre yorumlandı. Enterobacterales izolatlarında kolistin için klinik sınır değerler MİK ≤2 mg/lt duyarlı ve MİK >2 mg/lt dirençli olarak kabul edildi. Duyarlılık testleri, EUCAST 2022 önerileri doğrultusunda yalnızca SMD yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi ve sonuçlar buna uygun olarak yorumlandı (Şekil 1) (9).

Çalışma, Zonguldak Bülent Ecevit Üniversitesi Girişimsel Olmayan Klinik Araştırmalar Etik Kurulu tarafından 16 Eylül 2020 tarih ve 2020/18 karar numarasıyla onaylandı.

İzolatların Epidemiyolojik Analizi 

İzolatların epidemiyolojik ön analizi için rastgele başlatılmış polimeraz zincir reaksiyonu (arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR) yöntemi uygulandı (10). Bakterilerden DNA elde edilmesi için hazır ticari kit kullanıldı (GeneAll Exgene™ Clinic SV; GeneAll Biotechnology, Seul, Güney Kore).

Amplifikasyon ürünleri bromofenol mavisi içinde seyreltildikten sonra, içerisinde etidyum bromür bulunan %2’lik agaroz jele yüklendi. Marker olarak 100–2000 bp DNA ladder (GENESTA™, GeneAll Biotechnology, Seoul, South Korea) kullanıldı. Elektroforez işlemi, UV transilluminatörde (Gel Doc™ UV görüntüleme sistemi, Bio-Rad, Hercules, CA, ABD) 110 volt’ta 1 saat yürütüldü ve bant profilleri değerlendirildi (10).

Bantların analizinde kümeleşme incelemesi için ağırlıksız aritmetik ortalama ile çift gruplama (unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA) yöntemi, benzerlik hesaplamalarında Dice korelasyon katsayısı kullanıldı; %90’ın üzerinde benzerlik gösteren suşlar klonal ilişkili kabul edildi ve %90’ın altında benzerlik gösterenler farklı olarak değerlendirildi (10).

Plazmid Aracılı Direnç Genlerinin Araştırılması

Tablo 1. Hedef Gen Bölgesi Çoğaltılması İçin Kullanılan Primer Dizileri (11)

Bakteri DNA’sının çoğaltılması için A.B.T.™2X PCR MasterMix kit (Atlas Biyoteknoloji, Ankara, Türkiye) kullanıldı. Üretici firma önerileri doğrultusunda amplifikasyon karışımı hazırlandı ve amplifikasyon için Applied Biosystems GeneAmp® PCR System 9700 Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD) cihazı kullanıldı. Hedef DNA bölgesi için literatürde belirtilen amplifikasyon koşulları sağlandı (11). Kolistin direnci için Tablo 1’de verilen hedef gen bölgeleri kullanıldı.

BULGULAR

Tablo 2. İzolatların Elde Edildiği Klinik Örnekler

Ekim 2017–Ağustos 2020 tarihleri arasında laboratuvara gönderilen hasta örneklerinden 2567 K. pneumoniae izole edildi. Belirtilen sürede kolistin dirençli 48 K. pneumoniae izolatı olduğu saptandı. Aynı hastaya ait eş zamanlı gelen örneklerden sadece biri işleme alınarak 32 hastadan elde edilen 44 izolat değerlendirildi. İzolatların çoğu trakeal aspirat ve idrar örneklerinden elde edildi (Tablo 2).

Tablo 3. K. pneumoniae İzolatlarında Kolistin Direnç Oranlarının Yıllara Göre Dağılımı

Otomatize sistemle kolistine dirençli bulunan 44 izolatın 41’i SMD yöntemiyle kolistine dirençli bulundu. Çalışmaya dahil edilen kolistin dirençli suşların MİK90 ve MİK50 değerleri sırasıyla 64 μg/ml ve 16 μg/ml olarak bulundu. Otomatize sistemle dirençli bulunduğu halde SMD yöntemiyle duyarlı olduğu tespit edilen 3 izolatın MİK değerleri 0.5 μg/ml, 1 μg/ml ve 2 μg/ml olarak belirlendi. İzolatlardaki kolistin direnç oranının 2017 yılında %1.38 olduğu, 2018 yılında ise %0.18’e düştüğü görüldü; ancak bu oran 2019 yılında tekrar artış göstererek %1.61’e ve 2020 yılında daha da yükselerek %6.8’e çıktığı belirlendi (Tablo 3). Üç izolat karbapenemlerin tümüne duyarlı iken 8 izolat karbapenem grubundan sadece imipeneme duyarlı olarak tespit edildi. Ayrıca izolatların tamamında kinolon direnci saptandı.

Hastaların Demografik Özellikleri 

Belirtilen tarih aralığında 32 hastadan 41 kolistin dirençli izolat elde edildi. Bu izolatların elde edildiği hastaların yaş aralığı 20–92 yıl (ortalama: 63 ± 18 yıl) ve erkek/ kadın oranı 20/12 idi. Hastaların %56’sının yoğun bakım ünitesinde tedavi aldığı, %31’inin de servis öncesi yoğun bakımda yatış öyküsünün mevcut olduğu belirlendi.

İzolatların Moleküler Epidemiyolojisi 

Çalışmamızda yer alan 44 K. pneumoniae arasından, SMD yöntemiyle kolistin direnci doğrulanan 41 izolat için AP-PCR analizi yapıldı. İzolatlarda iki farklı AP-PCR profili gözlendi ve kümeleşme oranı %100 olarak bulundu. İçinde 37 izolatın yer aldığı genotip 1’in en büyük küme olduğu belirlendi. Benzerlik sınırı %90 olan çalışmamızda, genotip 1 ile genotip 2 arasında %83,.6 gibi yüksek oranda benzerlik olduğu görüldü.

Plazmid Aracılı Direnç Genlerinin Analizi 

Plazmid aracılı direnç genleri olan mcr-1, mcr-2, mcr-3, mcr-4 ve mcr-5 varlığının araştırılması amacıyla 41 kolistin dirençli K. pneumoniae izolatına multipleks PCR yapıldı ve 41 izolatın hiçbirinde araştırılan mcr genleri tespit edilmedi.

İRDELEME

Karbapenem dirençli Enterobacterales’in artışı, birçok ülkede kolistin kullanımını artırmış ve başlangıçta yalnızca kromozomal mutasyonlara bağlı olan direnç, 2015’ten itibaren dirençten sorumlu mcr genlerinin plazmid aracılığıyla yayılımı ile küresel bir sorun haline gelmiştir (12).

K. pneumoniae, hastane infeksiyonları ve antibiyotik direnci açısından kritik öneme sahiptir. 2016 yılında Avrupa, Kuzey Amerika ve Güneydoğu Asya’daki farklı ülkelerde mcr-1 geni taşıyan suşlar rapor edilmiş, aynı yıl İtalya’da lösemili bir çocuktan izole edilen KPC-3 enzimi üreten bir suşta mcr-1.2 varyantı bildirilmiştir (13,14). Fransa, Lübnan ve Laos’ta da benzer bulgular rapor edilmiştir (15,16). 2017 yılında Güney Kore’de mcr-1 ve blaKPC-2 genlerini birlikte taşıyan bir klinik suş izole edilmiştir (17). Daha sonraki yıllarda, Lübnan, Fas ve Katar’da mcr-8.1 geni; Belçika, Danimarka, Karadağ, Polonya, Sırbistan, Slovenya, Romanya ve İspanya’daki hasta örneklerinde ise mcr-9 geni tanımlanmıştır (18–20).

2025 yılında Çin’de kentsel kanalizasyon atık sularından elde edilen 366 izolatın 33’ü kolistine dirençli bulunmuş, bu izolatların 3’ünde (%0.83)mcr pozitifliği saptanmış olup bunların biri mcr-1 taşıyan E. coli, ikisi ise mcr-10 taşıyan Klebsiella quasipneumoniae subsp. similipneumoniae ve Klebsiella variicola subsp. variicola olarak belirlenmiştir. Daha önce insan, hastane atıksuyu, evcil hayvan ve tavuk gibi diğer hayvan örnekleri de dahil olmak üzere çeşitli çevresel örneklerde mcr-10 rapor edilmiş olmakla birlikte Çin’de yapılan bir çalışmada mcr-10’un atıksu arıtma tesisinde tespit edilmesi bir ilktir. Bu durum kentsel atık suların, antibiyotik direnç genleri için önemli bir rezervuar olabileceğini ve halk sağlığı için potansiyel bir risk oluşturabileceğini göstermektedir (21). 

Ülkemizde de mcr genleriyle ilgili ilk bildirim 2018 yılında Hatay-Adana bölgesinde tavuk etlerinden elde edilen E. coli izolatlarında yapılmıştır (22). K. pneumoniae’nın insan kaynaklı suşlarında ise mcr-1 2019 yılında bildirilmiştir (23). Trakya Üniversitesi’nde 2024 yılında yapılan bir çalışmada, kolistin dirençli K. pneumoniae izolatlarının tamamının mcr-1–mcr-5 genleri açısından negatif olduğu ve E. coli izolatlarında kolistin direnci saptanmadığı bildirilmiştir (24). Takip eden yıllarda, kolistin dirençli
K. pneumoniae oranlarında bir artış gözlemlenmiş olmakla birlikte mcr bildirimlerinde dikkat çekici bir artış kaydedilmemiştir (25,26). Çalışmaların bir bölümünde izolatlar arasında filogenetik inceleme yapılmadığı için direnç artışı oranlarının doğru yorumlanması zordur. Özellikle hastane ortamlarında kolistin dirençli suşların endemik hale gelmesi ve hastalar arasında horizontal bulaşma ile infeksiyonların yayılması, direnç oranlarındaki artış nedeni olarak değerlendirilebilir. Çalışmamızda, yapılan epidemiyolojik ön analiz ile izolatlar arasında iki farklı genotip saptandı ve bu genotipler arasında %83.6 oranında benzerlik bulundu. Bu benzerlik, hastalar arasında horizontal bulaşma olasılığını düşündürüyor.

Türkiye’de yapılan yakın tarihli bir çalışmada, sığır karkaslarından elde edilen E. coli O157 ve O157:H7 izolatlarında mcr-1 ve mcr-5 genlerinin sırasıyla %37.5 ve %25 oranlarında saptandığı bildirilmiştir (27). Türkiye genelindeki marketlerden ve kasaplardan toplam 180 perakende et örneği ile yapılan farklı bir çalışmada ise kuzu etlerinden elde edilen
E. coli izolatlarında mcr-1 ve mcr-2 genleri bulunmuştur (28). Ayrıca, Kasım 2020–Eylül 2022 tarihleri arasında farklı su kaynaklarından alınan 600 çevresel su örneğinden elde edilen Aeromonas spp. izolatlarında mcr-3 ve mcr-7 geni tespit edilmiştir (29). Şimdilik sınırlı sayıda olmakla birlikte, bu bulgular daha geniş kapsamlı bir gözetim ihtiyacını ve gıda amaçlı yetiştirilen hayvanlarda entegre izleme ve ihtiyatlı antimikrobiyal kullanım gereksiniminin önemini ortaya koymaktadır.

Çalışmamızda incelenen kolistin dirençli K. pneumoniae izolatlarında direnç oranlarının artış eğiliminde olduğu belirlendi. Yüksek MİK değerleri ile birlikte karbapenem ve kinolon direncinin saptanması, tedavi seçeneklerinin oldukça sınırlı olduğunu göstermektedir. Epidemiyolojik ön analizlerde izolatların çoğunlukla tek bir genotip altında kümelenmesi, izolatların klonal olarak ilişkili olabileceğini; plazmid aracılı mcr genlerinin tespit edilmemesinin ise kolistin direncinin büyük olasılıkla kromozomal mutasyonlara bağlı geliştiğini düşündürdü. Bu bulgular, güvenilir duyarlılık testlerinin uygulanması, dirençli izolatların izlenmesi ve antimikrobiyal yönetim stratejilerinin güçlendirilmesinin önemini göstermektedir.

Çalışmamızda kolistin direnci değerlendirmesi EUCAST 2022 kriterlerine göre yapılmış olmakla birlikte, sonuçlar EUCAST 2026 güncel önerileri ışığında yeniden ele alındığında yorumların büyük ölçüde geçerliliğini koruduğu görüldü. Her iki versiyonda da Enterobacterales için kolistin klinik sınır değeri değişmedi (MİK ≤2 mg/lt duyarlı, >2 mg/lt dirençli) ve referans yöntem olarak SMD yöntemi önerisi korundu. Bununla birlikte EUCAST 2026’ya göre değerlendirildiğinde kolistin duyarlılık testlerinin klinik ve epidemiyolojik belirsizlikleri daha güçlü biçimde vurgulandığı ve kolistinin “rutin antibiyogram antibiyotiği” olarak kullanılmaması gerektiğinin açıkça belirtildiği görüldü. Bu yaklaşım, EUCAST 2022’de mevcut olan metodolojik uyarıların 2026 versiyonunda daha belirgin ve kısıtlayıcı hale geldiğini göstermektedir. Özellikle EUCAST 2026’da sınır MİK değerlerine (2 mg/lt) sahip izolatların klinik açıdan dikkatle değerlendirilmesi gerektiği vurgulanmış; heterorezistans ve plazmid aracılı mcr genlerinin fenotipik testlerle her zaman saptanamayabileceği belirtilmiştir. Çalışmamızda EUCAST 2022’ye göre duyarlı olarak sınıflandırılan bazı izolatların, EUCAST 2026 bakış açısıyla klinik belirsizlik potansiyeli taşıyabileceği değerlendirilmektedir. Ayrıca EUCAST 2026, kolistin kullanımına ilişkin klinik önerileri daha da daraltmış; özellikle K. pneumoniae gibi çok ilaca dirençli etkenlerde kolistinin mümkün olduğunca kombinasyon tedavilerinde ve uygun doz optimizasyonu ile kullanılmasını önermiştir (30).

İzolatlarımızda kolistin direnç oranlarının yıllara göre değişkenlik gösterdiği, 2020 yılında ise belirgin bir şekilde yükseldiği saptandı. Bu artışın nedeninin tek bir etkene indirgenemeyecek biçimde, hastane ortamındaki çok sayıda faktörün eş zamanlı etkisiyle ilişkili olabileceği değerlendirilmektedir. COVID-19 pandemisi sürecinde yoğun bakım ünitelerinde hasta yükünün artması, yatış sürelerinin uzaması, invaziv girişimlerin daha sık uygulanması ve geniş spektrumlu antibiyotiklerin ampirik kullanımının yaygınlaşması, dirençli suşların seçilimini ve hastane içi dolaşımını kolaylaştırmış olabilir. Buna ek olarak, izolatların büyük bölümünün yoğun bakım ünitelerinden elde edilmesi ve moleküler analizlerde baskın bir genotipin saptanması, söz konusu dönemde gözlenen direnç artışında klonal yayılımın da katkıda bulunan faktörlerden biri olabileceğini düşündürmektedir.

Bu çalışmanın en önemli sınırlılığı, verilerin tek merkezden ve retrospektif olarak elde edilmesidir. Öte yandan plazmid aracılı kolistin direnç mekanizmalarının değerlendirilmesi mcr-1–mcr-5 genleri ile sınırlı tutulmuş olup çalışmanın yürütüldüğü dönemden sonra tanımlanan diğer mcr varyantlarının (mcr-6–mcr-10) ve olası alternatif direnç mekanizmalarının varlığı dışlanamamaktadır. Moleküler epidemiyolojik ön değerlendirmede kullanılan AP-PCR yöntemi, izolatlar arasındaki benzerliği ortaya koymak açısından yararlı olmakla birlikte “pulsed-field gel electrophoresis” (PFGE) veya “multilocus sequence typing” (MLST) gibi daha yüksek ayırt ediciliğe sahip yöntemlerle doğrulanması gereken bulgular mevcuttur. Son olarak, yıllar içinde gözlenen direnç artışının olası nedenleri; antibiyotik kullanım verileri, pandemi dönemine özgü bakım yükü ve infeksiyon kontrol uygulamalarındaki değişiklikler gibi ek parametrelerle nicel olarak değerlendirilemediğinden, bu artışa ilişkin net yorum yapılması mümkün olamadı.

Sonuç olarak, son çare antibiyotiklerden biri olan kolistine karşı gelişen direnç ve buna eşlik eden çoklu antibiyotik direnci, hastane infeksiyonlarının tedavisinde önemli bir sorun olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu nedenle, ulusal ve kurumsal düzeyde etkin sürveyans programlarının geliştirilmesi ve akılcı antibiyotik kullanımına yönelik stratejilerin yaygınlaştırılması gerekmektedir.