Özet

Amaç: Karbapenemazları kodlayan genlerin saptanmasında moleküler testlerin hızlı, güvenilir ve çeşitli seçeneklerinin bulunmasına karşın, maliyet, iyi eğitimli teknisyen ihtiyacı ve cihaz gereksinimleri bu testlerin yaygın kullanımını kısıtlamaktadır. Bu sorunları aşabilmek için son yıllarda geliştirilmiş olan izotermal amplifikasyon yöntemlerinden biri olan rekombinaz polimeraz amplifikasyon (RPA) yöntemi hedefin denatürasyonunu gerektirmez ve prob tabanlı saptama yöntemleriyle RPA ürünleri özel bir cihaz olmadan bile saptanabilir. Bu çalışmada RPA tabanlı izotermal amplifikasyon yöntemiyle yanal akım sistemi birleştirilerek blaOXA-48’i saptayacak hızlı ve sahada kolay uygulanabilir bir moleküler test formatının geliştirilmesi amaçlanmıştır.

Yöntemler: Bu çalışmada hastanemiz hastane infeksiyon kontrol komitesine ait karbapeneme dirençli ve duyarlı koleksiyon kökenleri (24 OXA-48-pozitif köken, birer VIM-, IMP-, NDM, KPC-pozitif köken ve 10 karbapeneme duyarlı OXA-48-negatif köken) çalışmaya dahil edildi. Kökenlerin Mueller-Hinton agarında 24 saatlik kültürleri hazırlandıktan sonra 1× polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tamponunda yoğunlukları 0.5 McFarland standardında olacak şekilde süspansiyonları hazırlandı. Testin performansının ve alt saptama sınırının belirlenmesi için OXA-48-pozitif kökenden de dilüsyonlar hazırlandı. Bu örneklerden kaynatma yöntemiyle nükleik asid izolasyonu yapıldı. Örnekler, tasarlanan blaOXA-48 RPA primerleri ve NFO probuyla, RPA yöntemi kullanılarak üretici (TwistAmp® nfo kit, TwistDx, Cambridge, Birleşik Krallık) talimatları doğrultusunda amplifiye edildi. RPA ürünlerinin saptanması için yanal akım yöntemi kullanıldı.

Bulgular: OXA-48 enzimini kodlayan bütün kökenler yaklaşık 45 dakikada hiçbir özel cihaza gerek duymadan saptandı. Saptama alt limiti 10 bakteri olarak belirlendi. Karbapenem direncine neden olan diğer enzimleri kodlayan kökenlerde ya da OXA-48 kodlamayan kökenlerde pozitif sinyal saptanmadı.

Sonuçlar: Yeni geliştirilen bu test formatı, uygulanmasının basit olması ve özel bir  cihaz gerektirmemesi dolayısıyla, bu tür enzimlerin taranması için gerek laboratuvar gerek saha koşullarında, diğer moleküler testlere (PCR, “real-time” PCR gibi) bir alternatif yöntem oluşturabilir. Klimik Dergisi 2018; 31(3): 185-9.

Cite this article as: Kuşkucu MA, Aygün G, Karakullukçu A, İmamova N, Küçükbasmacı Ö, Midilli K. [Development of a rapid molecular test format based on isothermal recombinase polymerase amplification technique and lateral flow method for detection of blaOXA-48]. Klimik Derg. 2018; 31(3): 185-9. Turkish.